合成生(born)物學的(of)步驟是(yes)确定好産品後,要(want)根據産品特性選擇合适的(of)底盤細胞,并設計基因線路,将設計好的(of)基因線路導入到(arrive)底盤細胞進行測試篩選,根據測試反饋對線路再進行修正得到(arrive)更好的(of)線路,如此反複構建最優細胞工廠,最終實現規模化生(born)産。因此,底盤細胞和(and)發酵工程是(yes)合成生(born)物學的(of)兩大(big)基石。
圖1. 基于(At)合成生(born)物學的(of)細胞工廠構建流程
資料來(Come)源:《中國(country)生(born)物工程雜志》
技術平台能力——多樣化底盤細胞
底盤細胞在(exist)合成生(born)物學中扮演着重要(want)的(of)角色。它們(them)是(yes)代謝反應發生(born)的(of)宿主細胞,通過将合成的(of)功能化元件、線路和(and)途徑等系統置入其中,以(by)達到(arrive)理性設計的(of)目的(of)。合成生(born)物的(of)底盤細胞包括模式生(born)物和(and)非模式生(born)物兩類,模式生(born)物被選定用(use)于(At)揭示某種具有普遍規律的(of)生(born)命現象,因此研究較爲(for)深入、遺傳改造工具較多。目前常見的(of)底盤細胞有大(big)腸杆菌、谷氨酸棒杆菌、釀酒酵母、絲狀真菌、巴斯德畢赤酵母等。
圖2. 多種底盤細胞的(of)優劣勢對比
資料來(Come)源:《2023合成生(born)物驅動美麗健康消費品産業報告》
明星底盤細胞—畢赤酵母
巴斯德畢赤酵母,是(yes)甲醇營養型酵母中的(of)一(one)類能夠利用(use)甲醇作(do)爲(for)唯一(one)碳源和(and)能源的(of)酵母菌。與其它酵母一(one)樣,在(exist)無性生(born)長期主要(want)以(by)單倍體形式存在(exist),當環境營養限制時(hour),常誘導2個(indivual)生(born)理類型不(No)同的(of)結合型單倍體細胞交配,融合成雙倍體。
1.提取工藝
取廢畢赤酵母泥→按其幹重配成一(one)定濃度的(of)懸浮液50 mL(含一(one)定濃度的(of)NaOH)→在(exist)一(one)定溫度下保溫提取一(one)定時(hour)間→離心→棄去殘渣→上(superior)清液濃縮,加四倍量的(of)乙醇→低溫過夜→離心取沉澱→測定多糖含量。
2.開發價值
(1)畢赤酵母——酵母表達的(of)高分選手
作(do)爲(for)真核生(born)物,畢赤酵母具有高等真核表達系統的(of)許多優點:如糖基化、信号肽追加等後轉譯能力,且實驗操作(do)簡單。它比杆狀病毒或哺乳動物組織培養等其它真核表達系統更快捷、簡單、廉價,且表達水平更高。同爲(for)酵母,畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的(of)分子及遺傳操作(do)優點,且它的(of)外源蛋白表達水平是(yes)後者的(of)十倍以(by)至百倍。
(2)利用(use)畢赤酵母可篩選到(arrive)高表達菌株
通過質粒整合到(arrive)畢赤酵母基因組的(of)外源基因結構穩定,不(No)易丢失;且外源基因能以(by)高拷貝數整合到(arrive)畢赤酵母基因組中,能夠篩選到(arrive)高表達菌株。(3)有利于(At)外源基因的(of)調控表達的(of)基因畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)基因的(of)強啓動子特别适用(use)于(At)外源基因的(of)調控表達。由于(At)酵母本身僅分泌少量蛋白,,因此外源蛋白占培養基中總蛋白的(of)絕大(big)多數,這(this)大(big)大(big)降低了(Got it)蛋白質分純的(of)難度。
利用(use)畢赤酵母系統可以(by)生(born)産醫用(use)高效蛋白質,如用(use)畢赤酵母生(born)産的(of)重組蛋白有牛胰蛋白酶原、人(people)2A型蛋白磷酸酯酶(PP2A)亞基、乙型肝炎病毒前S1蛋白、戊型肝炎病毒開讀框架2片斷、人(people)白介素-2、腫瘤壞死因子。另外腫瘤細胞的(of)一(one)個(indivual)關鍵的(of)蛋白酶MT1-MMP,在(exist)删去C末端跨膜區後,轉化酵母并獲得表達,這(this)對于(At)癌症的(of)治療有重要(want)的(of)意義。蓓晶醫用(use)重組III型人(people)源化膠原蛋白就是(yes)利用(use)重組基因工程法通過畢赤酵母菌表達系統研制而成。
底盤細胞優化
由于(At)細胞的(of)複雜性,人(people)工置入的(of)生(born)物元件、線路或系統往往會受到(arrive)細胞内原有代謝與調控途徑的(of)影響。因此,爲(for)了(Got it)實現合成生(born)物學的(of)目标,需要(want)在(exist)多個(indivual)方面進行研究和(and)優化。
模式微生(born)物方面,George Church團隊在(exist)大(big)腸杆菌中開發的(of)多重自動化基因組工程進行大(big)規模的(of)細胞編程和(and)進化等。2023年趙惠民團隊開發了(Got it)以(by)釀酒酵母爲(for)細胞底盤的(of)RNAi輔助的(of)自動化基因組進化方法RAGE。
在(exist)非模式底盤方面,中國(country)科學院天津工業生(born)物技術研究所王猛團隊依托高通量基因編輯與篩選自動化平台,在(exist)谷氨酸棒狀杆菌中開發了(Got it)多元自動化基因組編輯方法MACBETH,實現了(Got it)質粒構建、基因組編輯、克隆篩選和(and)表型驗證的(of)全流程自動化操作(do),可實現每月數千突變株的(of)編輯。此外,該團隊還開發了(Got it)基于(At)液滴微流控的(of)鏈黴菌高通量培養和(and)篩選技術,檢測分選速度達到(arrive)每小時(hour)1萬菌株,人(people)工混庫的(of)單輪分選富集率超過了(Got it)330倍。
構建底盤細胞挑戰
在(exist)微生(born)物細胞工廠的(of)構建過程中,需要(want)解決諸多挑戰。例如,超過99%的(of)已知微生(born)物難以(by)在(exist)實驗室培養,且易出(out)現生(born)長速度緩慢、編碼基因不(No)表達等情況;其二,天然産物的(of)生(born)物合成水平較低,野生(born)型菌株的(of)次級代謝産物合成水平通常在(exist)mg/L水平或更低,造成了(Got it)活性天然産物分離鑒定和(and)活性測定的(of)困難。
規模化生(born)産核心能力——發酵工程
高性能菌株從實驗室走向工業化生(born)産還需要(want)經曆小試、中試、量産等關鍵環節,這(this)就需要(want)企業構建高效發酵優化放大(big)能力來(Come)滿足高通量菌株性能驗證及發酵工藝開發能力的(of)需求,從而讓實驗室構建好的(of)高性能菌株邁向大(big)規模生(born)産階段。中國(country)生(born)物發酵産業全球規模第一(one)、影響廣泛,中國(country)的(of)發酵産能幾乎占到(arrive)全球市場的(of)70%。發酵工程其實就是(yes)技術落地(land)的(of)過程,而合成生(born)物作(do)爲(for)典型的(of)技術密集型行業,從“克”到(arrive)“千克”,再到(arrive)“噸”的(of)放大(big),不(No)是(yes)一(one)個(indivual)簡單的(of)過程,每一(one)個(indivual)步驟都需要(want)重新摸索和(and)優化,需要(want)考慮不(No)同規模下發酵設備、發酵參數的(of)變化。底盤菌是(yes)微生(born)物,不(No)像大(big)部分化工原料是(yes)無機物,能非常精确地(land)知道石油在(exist)不(No)同溫度和(and)壓力條件下的(of)表現以(by)及如何使加工廠标準化,以(by)使每個(indivual)獨立的(of)單元都能高效運作(do),并且可複制,從而制造出(out)質量統一(one)的(of)産品。微生(born)物會對不(No)同環境有不(No)同的(of)反應,在(exist)放大(big)生(born)産過程中,對于(At)代謝調控、微生(born)物抗逆性等要(want)求很高。生(born)産規模上(superior)發酵體積每增加10倍,生(born)産成本下降37%-60%,規模效應明顯,但發酵規模越大(big)發酵難度也更大(big),一(one)個(indivual)1升規模的(of)發酵罐中,溫度、壓力等等各種條件都容易控制,但将規模從1升提高到(arrive)1萬升,相當于(At)引入了(Got it)1萬個(indivual)獨立的(of)微環境,微生(born)物、發酵生(born)産過程中溫度、pH值、代謝産物積累等都将影響發酵的(of)結果罐需要(want)機械攪拌以(by)保證基質、氧氣和(and)熱量的(of)均勻分布,同時(hour)需要(want)防範發酵過程中的(of)染菌風險。
傳統輕工業如醋、酒、醬等的(of)釀造過程,以(by)及大(big)宗發酵産品如氨基酸、有機酸、核酸等産品的(of)發酵産業在(exist)我(I)國(country)曆史悠久。傳統的(of)發酵優化方法,主要(want)包括菌種選育、培養基及培養條件的(of)優化、反應器結構優化等。傳統菌種選育包括自然選育、人(people)工誘變選育等在(exist)高性能菌種篩選中發揮了(Got it)重要(want)作(do)用(use),也爲(for)基因工程菌的(of)馴化以(by)适應工業生(born)産環境提供了(Got it)重要(want)技術基礎。在(exist)發酵過程優化方法的(of)研究中,主要(want)集中在(exist)最适發酵溫度、接種濃度、最适pH、最适C/N 比等靜态條件的(of)優化,這(this)些方法在(exist)氨基酸、有機酸、核酸發酵優化、抗生(born)素及次級代謝産物發酵優化等方面獲得了(Got it)廣泛應用(use),并在(exist)推動我(I)國(country)發酵産業技術進步方面發揮了(Got it)重要(want)作(do)用(use)。此外在(exist)反應器結構與形式方面也進行了(Got it)諸多研究,包括不(No)同攪拌槳及通氣形式的(of)改進、适用(use)于(At)剪切敏感的(of)絲狀菌發酵的(of)氣升式反應器開發與應用(use)等,對提升發酵産率和(and)發酵效率起到(arrive)重要(want)作(do)用(use)。
發酵工程優化的(of)核心是(yes)确定操作(do)條件與菌體代謝特性之間的(of)關系,并利用(use)這(this)個(indivual)關系調控操作(do)條件使菌體的(of)生(born)理代謝特性朝向有利于(At)産物合成的(of)方向,從而達到(arrive)優化目标。因此,傳感技術是(yes)發酵過程優化中必不(No)可少的(of)一(one)項關鍵技術。發酵優化領域中多種先進傳感技術得以(by)應用(use),其中影響最大(big)、效果最明顯的(of)是(yes)發酵尾氣分析技術。如嘉必優公司在(exist)進行花生(born)四烯酸發酵過程放大(big)中,應用(use)發酵尾氣分析獲取過程RQ值,并通過不(No)同氮源補加策略控制RQ值,将發酵工藝直接放大(big)到(arrive)200 m3發酵罐,發酵效價從11.93 g/L提升到(arrive)16.82 g/L,成本降低11.2%。除此之外,近年來(Come)發展起來(Come)的(of)胞内代謝物實時(hour)熒光檢測技術也日趨發展成熟,由華東理工大(big)學楊弋教授團隊開發的(of)分子探針可實現NADH、NADPH及各種胞内氨基酸分子含量的(of)實時(hour)定量測定。将此技術與發酵過程在(exist)線傳感技術結合,可大(big)幅提升發酵過程在(exist)線檢測參數的(of)廣度和(and)深度,從而更快、更直接地(land)獲取微生(born)物胞内代謝狀态,使發酵過程更快、更精準地(land)得到(arrive)預測和(and)控制。發酵過程優化裝備—高通量平行反應器裝備開發與應用(use)高效發酵優化對裝備方面的(of)要(want)求是(yes)如何提高發酵實驗的(of)通量,而再現工業規模反應器内環境的(of)微型化平行反應器裝備是(yes)實現發酵實驗通量提高的(of)關鍵。合成生(born)物學的(of)發展催生(born)了(Got it)一(one)系列高通量篩選裝備及其自動化的(of)相關技術。目前從平闆制備、單克隆挑選、孔闆自動化培養及孔闆的(of)自動檢測等已形成一(one)系列裝備和(and)技術,使得菌種構建後篩選效率大(big)幅提升,據稱利用(use)高通量自動化裝備Biofoundry平台,可實現每天千萬株篩選水平。在(exist)自動化配料裝置、自動取樣分析裝置等方面,國(country)内天木生(born)物走在(exist)前列,其開發的(of)在(exist)線自動取樣裝置在(exist)國(country)内多家科研院所、生(born)産企業獲得成功應用(use)。數字孿生(born)有望成爲(for)推動發酵過程實現智能化的(of)核心技術高效發酵優化放大(big)技術正推動發酵過程向大(big)數據發展。随着發酵數字化基礎設施的(of)逐漸完善,以(by)及整個(indivual)制造業向數字化、智能化轉型升級,基于(At)數字孿生(born)系統的(of)過程模拟、預測、優化策略、甚至自動優化調控等一(one)定會進一(one)步加速發酵過程的(of)優化和(and)放大(big)進程。歐美國(country)家在(exist)發酵過程的(of)數字孿生(born)技術方面正投入大(big)量研發力量,其中較爲(for)活躍的(of)包括通用(use)公司、DSM公司、西門子公司以(by)及代爾夫特理工大(big)學、丹麥理工大(big)學、英國(country)帝國(country)理工大(big)學等。奧地(land)利初創公司Novasign開發了(Got it)基于(At)混合模型的(of)數字孿生(born)系統,運用(use)該系統對大(big)腸杆菌表達超氧化物歧化酶的(of)過程進行優化,加速發酵過程優化的(of)進程。我(I)國(country)學者通過與國(country)外科研機構合作(do)也在(exist)發酵過程數字孿生(born)技術方面做了(Got it)嘗試。例如:華東理工大(big)學與代爾夫特理工大(big)學及 DSM 公司的(of)國(country)際合作(do)項目,合作(do)發表了(Got it)将反應器流場和(and)産黃青黴産青黴素的(of)動力學模型整合的(of)數字模型,用(use)于(At)工業規模發酵過程的(of)縮小設計及過程優化。未來(Come)随着AI技術更加成熟,其與發酵技術的(of)深度融合将颠覆傳統發酵技術手段。數字孿生(born)将成爲(for)發酵企業的(of)标準配置,借助知識圖譜技術輔助,發酵工程師進行發酵過程的(of)智能分析和(and)優化調控将變得更加便利高效,AI賦能的(of)高效發酵技術爲(for)生(born)物經濟發展起到(arrive)高效支撐作(do)用(use)。此外,大(big)規模發酵生(born)産中,實現綠色制造也至關重要(want),如采用(use)農作(do)物稭稈、林業廢棄物等非糧生(born)物質原料替代糧食能源、清潔生(born)産(不(No)采用(use)化學試劑、重金屬催化劑)、三低控制(低能耗、低污染、低碳排放)以(by)及生(born)物固碳等。
結語
投資合成生(born)物學,應遵循“短期看選品,長期看平台”的(of)原則。短期,關注那些已有成熟市場或巨大(big)潛力、成本領先的(of)産品;長期,則注重企業是(yes)否有平台化擴展能力,如多樣化底盤細胞和(and)發酵工程能否能通過自動化、AI等技術實現持續創新。
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